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磁性微球在核酸纯化上的应用
时间:2021-01-18
核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础,除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外,它与生命的异常情况,如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究,还是进行基因工程、蛋白质工程,首先需要对核酸进行分离纯化。
    超顺磁性微球是细胞分离、鉴定、基因分析、细菌和病毒等病原体诊断、核酸分离分析、蛋白质纯化的一个有效手段。通过寡聚核苷酸
[Oligo(dT)]序列或链霉亲和素等将DNARNA连接到磁性微球的表面已开发了许多应用。
       
DNA/RNA结合蛋白分离
    在基因表达中,蛋白质也是一个重要角色,然而与
DNA/RNA特异性结合的蛋白质通常寿命都很短,且含量少,链霉亲和素修饰的磁珠可用来提取分离DNP/RNP。结合有生物素的DNARNA序列与链霉亲和素修饰的磁珠相互作用,蛋白质识别了这些序列,就可在几分钟内结合到固定化DNA/RNA上,这种方法已被用来分离转录因子,限制性内切酶,复制蛋白等。
         
mRNA分离
    在基因表达的研究中,结合免疫磁性细胞分离和基于磁珠分离后进行逆转录(
Reverse transcription)及聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, RT-PCR)扩增,是一种强有力的手段。典型哺乳动物一个细胞中只有大约10 pgRNA,而mRNA则仅占总RNA1-5%。传统的mRNA分离技术需要总RNA纯化,即基于Oligo(dT)-纤维素亲和色谱柱的PolyA+RNA选择,此过程费时费力。因此,Oligo(dT)25磁性微球被用于从复杂溶菌液中提取mRNAPoly(A)-tailmRNA序列上普遍存在的一段碱基,因此磁珠表面只需要有Oligo(dT)25序列,就可以有效地与mRNA上Poly(A)-tail杂交,这种杂交非常迅速,在1-2 min内就可完成,能有效地除去rRNAtRNA以及其他RNA,且有70-100%的回收率。除去溶菌液的洗涤,整个提取只需耗时15 min,且只用一个管,也不必进行前面的纯化步骤。利用Oligo(dT)25磁性微球可在一小时内从单核细胞和T-淋巴细胞,B-淋巴细胞等中提取出mRNA,磁珠也可以经过改性后对血液、骨髓中的癌细胞进行检测或进行单核细胞(mononuclear cell)制备。此外,磁珠还可从动、植物组织中分离Mrna,比如,曾有人从血清、血浆、骨髓液中分理出聚腺苷酸(polyadenylated viralRNA病毒,HIV-1RNA,从肝、脾、植入石蜡组织,以及果蝇中都提出了mRNA
    利用这些磁珠从动、植物细胞、组织等复杂样品中提取的
mRNA,可用于构建cDNA文库。Oligo(dT)25磁珠消除了总RNA纯化,柱色谱处理,过滤,有机溶剂提取,醇沉淀等过程,酶的下游应用也不会因为磁珠的存在而受到抑制。Oligo(dT)25磁性微球最重要的特性还在于可定量提取mRNA,使得定量RT-PCR和环境监测成为可行。实现mRNA提取高通量也已成为可能,FangOtto等已报道了96孔板和384孔板磁分离,可同时进行96384个样品的提取。
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