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细胞凋亡:六种最佳测定方法
时间:2020-11-24
       细胞凋亡是程序性细胞死亡的高度调控形式,在多细胞生物发育过程中、整个生命周期以及对细胞应激作出反应时均可发生细胞凋亡。核固缩、细胞皱缩、质膜出泡和 DNA 断裂是细胞凋亡的典型特征。
Caspases 蛋白水解酶家族充当着细胞凋亡的中心调节因子,而其活性又由多种其他促凋亡和抗凋亡蛋白所平衡。细胞凋亡的失调发生在多种疾病(包括自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症)中,并且是这些疾病的病理机制之一。因此,了解这些疾病的细胞凋亡过程有利于疾病治疗的研究进展。
尽管目前有好几种检测细胞凋亡的方法,但要根据您的实验模型选择合适的检测方法。例如:

 

  • 对细胞悬浮液进行 Annexin V 染色后,通过流式细胞仪可以有效地识别细胞凋亡早期脂质双层的变化。但是,这种检测不太适合完整的组织标本,否则结果难以量化和解释。

  • 相反,其他细胞凋亡标记,如 Cleaved Caspase-3 和核酶多聚二磷酸腺苷核糖 (ADP-ribose) 聚合酶 (PARP),更适合用传统的免疫组织化学方法在组织切片中检测。

一般而言,细胞凋亡检测旨在检测多个细胞生物过程,这些生物过程提示凋亡信号通路的激活。除上述两种标记方法外,细胞凋亡检测还包括:

  • 使用 DNA 染料染色(例如 DAPI 和 Hoeschst 33342)来观察染色质凝聚。

  • 使用末端脱氧核苷酸转移酶介导 dUTP 缺口末端标记法 (TUNEL) 检测以及其他亚细胞定位标记(包括 细胞色素 C 从线粒体到细胞质的转位)确定 DNA 链断裂和碎片裂解。

  • 此外,线粒体膜电位本身是细胞健康状态的关键指标,其损耗与非活性、功能失调的线粒体,因此,它是细胞凋亡的早期指标,可以在与细胞可渗透阳离子染料 TMRE(四甲基罗丹明乙酯)孵育后进行检测。TMRE 通常在健康完整线粒体中累积,因此,当线粒体膜电位被破坏时,荧光强度降低。


由于细胞凋亡通常是一个短暂的过程,因此有必要使用多种方法来确定其发生。同样地,使用多个标记检测可以深入了解您的模型系统中细胞凋亡的动力学,并将它与其他细胞死亡形式(如坏死)区分开。
另外,细胞死亡与促存活信号级联反应之间的平衡是大多数细胞凋亡检测方法的重点。对细胞存活的级联信号进行研究,可以进一步深入了解您的实验模型下细胞死亡的机制。例如:

  • 生长因子和细胞因子通过 PI3K/Akt 途径诱导的信号转导会导致促凋亡的 Bcl-2 家族成员 BadBaxcaspase-9GSK-3 和 FoxO1 的磷酸化和抑制,以及抗细胞凋亡蛋白如 Bcl-2 的上调。

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